2020年8月，江南大学传统酿造食品研究中心科研团队与浙江古越龙山绍兴酒股份有限公司、美国加州大学戴维斯分校在国际期刊LWT-Food Science And Technology联合发表了题为“Feedback inhibition of the prephenate dehydratase from Saccharomyces cerevisiae and its mutation in huangjiu (Chinese rice wine) yeast”的研究论文，文章基于预苯酸脱水酶突变位点分析其三维结构模型，比较了来自黄酒酵母HJ01和模式酵母W303的PHA2基因编码的预苯酸脱水酶的酶学特性，分析了其酶学动力学以及L-Phe对其抑制动力学。本论文审稿过程中受到了国际同行的高度评价，认为本论文的研究对于解析黄酒酵母的β-苯乙醇合成调控具有重要意义。
LWT是国际食品科学与技术领域的顶级学术刊物之一，该杂志主要发表与食品的化学/生物化学以及分析方法相关的原创性研究进展，中科院分区食品科技1区TOP，最新影响因子4.006。
主题 |
黄酒酵母预苯酸脱水酶研究 |
中科院分区基础版 |
工程技术2区 |
中科院分区升级版 |
农林科学1区 |
五年影响因子 |
5.488 |
最新影响因子 |
4.006 |
作者 |
刘双平 |
通讯作者 |
毛健 |
单位 |
江南大学传统酿造食品研究中心 |
原文链接 |
https://doi.org/10.1016/j.lwt.2020.110040 |
内容概要
2-苯乙醇是酱油、料酒、黄酒、葡萄酒、白酒、醋等发酵食品中的重要风味物质。其中，黄酒含有较高浓度的2-苯乙醇(40-130 mg/L)，对其独特香气的形成起着重要作用。研究表明，酒精饮料中的2-苯乙醇主要由酿酒酵母产生，酿酒酵母也是黄酒酿造中的核心功能微生物。在酿酒酵母中，2-苯乙醇是由莽草酸和艾氏途径中的酶合成的，而预苯酸脱水酶是莽草酸途径中关键的酶。预苯酸脱水酶(PDT)催化预苯酸脱水为苯丙酮酸。在大多数细菌中，在大多数细菌中，PDT是双功能蛋白PheA的一部分，它包含两个催化域以及一个R结构域。在大肠杆菌中，L-苯丙氨酸对苯丙氨酸的反馈抑制作用有助于调节L-苯丙氨酸生物合成中的代谢通量。
文中首先对于来自黄酒酵母HJ01和酿酒酵母W303的PHA2基因，进行了克隆与亚克隆构建，然后对其蛋白的三维结构进行了模拟及分析后发现有3个位置的氨基酸产生了突变差异，基于前期酿酒实验结果发现当前体物质L-Phe耗尽后，两个发酵过程中的2-苯乙醇浓度显著增加，但在Pha2pHJ01中观察到的突变对PDT活性的影响是未知的。
接着通过诱导表达基因工程菌，亲和层析手段获得纯酶后比较了其酶活，Pha2pHJ01的比活性大于Pha2pW303的比活性。Pha2pHJ01较高的比活性可增加对2-苯乙醇生物合成的代谢通量，从而提高黄酒的2-苯乙醇浓度。
前期分子对接结果表明，在L-Phe存在下，Pha2pW303和Pha2pHJ01的PDT活性显著降低，通过L-Phe对PDT的酶活性抑制分析发现Pha2pHJ01的突变导致对L-Phe的反馈抑制抗性增加。进而通过PDT的无抑制动力学和L-Phe对PDT的抑制动力学分析发现Pha2pHJ01中存在的突变提高了其催化效率，这是其在发酵过程中活性明显增加的主要原因。且L-Phe对PDT为竞争性抑制动力学，Pha2pHJ01比Pha2pW303更能抵抗反馈抑制，并且Pha2pHJ01的比活性也高于Pha2pW303，kcat和催化效率(kcat/Km)也高于Pha2pW303。最后对Pha2pW303和Pha2pHJ01的pH和温度稳定性进行了比较研究。
重要意义
本研究证实了来自模式菌株的Pha2pW303以及存在于黄酒发酵过程中的Pha2pHJ01的反馈抑制。基于L-Phe的X-射线晶体结构的Pha2p结构模型表明L-Phe抑制PDTCt的变构调节。通过实验抑制常数(Ki)值表明Pha2pHJ01比Pha2pW303更能抵抗反馈抑制，且Pha2pHJ01的比活性也高于Pha2pW303，kcat和催化效率(kcat/Km)也高于Pha2pW303。本文的研究成果将有助于提升消费者和生产者对黄酒的科学认识，同时也为后续研究黄酒比其他发酵食品具有更高的2-苯乙醇浓度的原因奠定了理论基础，对于促进黄酒酵母的研究发展具有积极的指导意义。
本研究由以下基金项目资助：国家自然科学基金(31701593)，国家重点研发项目(2018YFD04004001)，江苏省科协青年杰科技人才托举工程，国家轻工技术与工程一级学科计划（LITE2018-13）和中央高校基本科研业务费专项资金 (JUSRP21932)。
撰稿|杨琪琳
校稿|刘双平
