江南大学毛健团队，依托“泸州老窖-江南大学国宝生态研究协同创新中心、古越龙山-江南大学黄酒酿造创新实验室”两大平台，于2025年5月在国际期刊Food Quality and Safety 上发表了题为“Development of a High-Precision Quantitative Analysis Detection for three Yeasts Based on CRISPR/Cas12a（基于CRISPR/Cas12a的三种酵母高精度定量分析检测方法的开发）”的研究论文，该研究建立了酿造体系中三种酵母（酿酒酵母、异常威克汉姆酵母和拜耳接合酵母）的快速检测方法，可在45分钟内完成目标酵母的绝对定量，相比于传统公认的实时聚合酶链式反应（qPCR），该方法灵敏度大幅提高，定量限和检测限分别为 100 copies/μL和1copy/μL。这项技术的成功开发为酿造体系中核心关键微生物的“分钟级”精确定量检测立下关键里程碑，将现代化的精准控制技术融入传统酿造工艺之中，为行业的高质量发展带来创新动力，有力推进酿造工艺现代化，提升生产效率，降低企业生产成本，确保产品安全性。本论文获得了国家自然科学基金重点项目（22138004和22422807）、国宝生态研究协同创新中心的支持。

研究背景

• 酿造酵母在酿造体系中广泛存在，种类繁多，能产生酯类、醇类、有机酸等风味化合物，对酿造食品品质产生重要影响，因此准确、快速地监测酿造酵母十分重要。然而，传统的酿造酵母检测方法大多存在问题，例如依赖于可培养方法或显微镜观察的方法，往往存在检测灵敏度低、操作繁琐、时间长、难以区分近缘物种等问题；测序技术方法检测成本较高，分析周期耗时长，且在种水平鉴定方面可能存在准确性不足的问题；qPCR技术方法在酿造酵母检测方面仍存在特异性不足和受到复杂基质抑制（如腐殖酸）的问题。

•   针对以上问题，本研究选择了酿酒酵母、异常威克汉姆酵母和拜耳接合酵母三种在酿造体系中常见的核心酵母作为检测对象，通过生物信息学方法和qPCR实验结合筛选三种酵母的物种特异性基因，进一步基于CRISPR/Cas12a系统建立酿造酵母绝对定量检测方法，即一锅式的一步法（One-step RPA-CRISPR/Cas12a， ORCC）检测方法。结果表明，ORCC检测方法可在45 min内完成目标酿造酵母的绝对定量，定量限和检测限分别为100 copies/μL和1 copy/μL，非目标酵母之间无交叉反应。在真实酿造样品中，ORCC检测方法可以定量目标酵母，但qPCR检测方法无法定量；在加标酿造样品中，qPCR检测方法的回收率整体低于ORCC检测方法。本研究对于实时反映生产过程中精准监测酿造酵母的动态变化，实现传统酿造食品酿造过程现代化有重要意义。

文章作者

• 该论文第一作者是江南大学传统酿造食品研究中心扈晋嫣硕士，通讯作者是毛健教授、刘双平教授和涂荣坤正高级工程师。

研究亮点

（1）提出了一种一锅式的一步法（One-step RPA-CRISPR/Cas12a，ORCC）检测方法，避免开盖转移操作，降低污染风险，可在45分钟内完成酿造酵母的绝对定量检测。

（2）目标酵母的定量限（LOQ）为100 copies/μL，检测限（LOD）为1 copy/μL。

（3）方法对目标酵母具有极高的特异性，与19种非目标酵母无交叉反应。

（4）在模拟和真实酿造样本中均进行了验证，检测结果稳定可靠。

图文摘要

图文赏析

图1 ORCC体系各组分优化前后的检测性能对比

图2 ORCC检测方法的特异性评估与标准曲线的建立

图3 ORCC检测方法的应用

原文链接：https://doi.org/10.1093/fqsafe/fyaf017